摘要： 一提到免疫学，你通常会想到根据细胞的大小和粒度以及荧光标记来分析（或分选）大量的细胞。流式细胞仪能够根据抗原受体的存在对免疫细胞进行分型，比如CD4和CD8抗原的表达。细胞内抗原的染色已变得司空见惯，而分泌的蛋白（如细胞因子）甚至也能同时捕获和观察。 

免疫系统不仅影响着疾病状态，也影响科学研究 – 从疫苗开发到白血病，从传染病到关节炎，从免疫治疗到自身免疫。这些领域的探索需要运用各种技术和仪器，从细胞毒性分析到质谱分析。这些技术交织在一起，形成协同效应，比如免疫治疗就综合了免疫学和细胞治疗的原理。

       每个实验室在研究具体问题时，无疑都有自己的一套技术。不过，一些新的趋势正在兴起。毫无疑问，这并不是免疫学所独有的。但话说回来，免疫学的问题也不属于单个学科。 

       多维度分析

        一提到免疫学，你通常会想到根据细胞的大小和粒度以及荧光标记来分析（或分选）大量的细胞。流式细胞仪能够根据抗原受体的存在对免疫细胞进行分型，比如CD4和CD8抗原的表达。细胞内抗原的染色已变得司空见惯，而分泌的蛋白（如细胞因子）甚至也能同时捕获和观察。 

       宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室的主任Eline Luning Prak认为：“目前有着更多维度分析的趋势，这样细胞将有着更好的表型分辨率。”这能够在白血病和淋巴瘤治疗后更好地追踪残留疾病，也能够寻找克隆演化。

     “最多15种颜色……流式是目前最好的，”斯坦福大学欧洲杯竞猜平台人类免疫监控中心（HIMC）的主任Holden Maecker如是说。不过他提到了另一个更令人兴奋的产品，Fluidigm的CyTOF质谱流式细胞仪。这台仪器有点像流式细胞仪，不过不是利用光检测器来区分荧光标记的抗体，而是利用原子质谱仪来区分同位素金属结合的抗体。 

    “它真的扩展了你在单管中所能开展的分析，并连接了所有数据，”Maecker解释道。当然，没有什么是完美的。CyTOF仪器要比流式细胞仪贵得多，而且它更慢 – 每秒500个细胞，相对而言流式细胞仪每秒能分析多达10,000个细胞。“当你讨论稀有细胞，或分析500个样品时，这就是真正的差异，”他说。

       分析这么多的参数，也往往意味着这种技术会超出我们分析数据的能力。研究人员正在利用概率分组、SPADE和概率状态建模，来分析多色流式细胞仪和CyTOF的数据。Prak指出：“你不能指望你的头脑。你需要建立一个模型，系统地比较同一患者在不同时间的样本，或比较这种疾病和那种疾病的患者，并让电脑说出它们之间的差别，而不仅仅是目测。” 

       检测新力量

       流式细胞仪不仅能分析蛋白质，也能分析RNA。利用Affymetrix的PrimeFlow™ RNA分析，透化的细胞与互补的寡核苷酸探针一起孵育。之后通过分支DNA（bDNA）信号扩增技术和传统的流式细胞仪，可检测RNA。Affymetrix负责eBioscience业务的高级副总裁                                          Dara Grantham Wright表示：“我们最多检测三种RNA，并同时检测五种蛋白质。”

       默克密理博的SmartFlare™技术也通过连着双链寡核苷酸序列的纳米金颗粒来完成相似的目标。这些探针通过内吞作用进入活细胞。当目标RNA与纳米金颗粒上的“捕获链“结合时，“报告链”被释放，上面的荧光基团会发出荧光，通过荧光检测平台检测到。 

       组织样本上的RNA原位杂交也可以通过Affymetrix的ViewRNA分析来开展。这种技术让研究人员能查看多个目标的转录本，从而检测编码分泌蛋白（如细胞因子）的RNA，研究非编码RNA，以及寻找抗体难以制备的蛋白的转录本。

      新一代测序 

      单细胞中的RNA也可以通过NGS来发现。“我们称之为靶向RNA-Seq。通常，我们分选单个T细胞，要么使用四聚体作为探针，这样我们就有了抗原特异的T细胞。或者，如果我们有肿瘤的活检标本，我们就拿到所有T细胞，因为我们认为它们的存在肯定有原因，”Maecker解释道。“之后我们开展cDNA合成，并扩增我们感兴趣的大约70个基因，包括T细胞受体（TCR）。这样我们就得到了每个细胞的TCR序列，我们也得到了其他一堆基因的表达水平。

       通过查看TCR序列，“我们能够看到克隆的历史，我们也能查看这些克隆的表型，“Maecker补充道。“这是我们第一次将特异性和表型相联系，否则是做不到的：要么做测序，要么做表型分析。” 

       有了清楚定义的序列条形码（作为标签），人们能将数百个孔的cDNA合并在单个深度测序运行中，使得单细胞靶向RNA-Seq更加专注，也便宜得多。

       当然，NGS也可以用来查看整个基因组。例如，“免疫组库分析 – 对B细胞受体和TCR重排的高通量测序是研究界的一个主要领域，”Prak认为。“它目前尚未应用于临床，但我想可能快了。它适合微小残留病的检测，最终也许适合自身免疫的分析。” 

       真正将免疫学捆绑在一起的是对免疫系统的关注。我们试图理解先天性和特异性免疫的工作方式，以及它何时会导致疾病，比如淋巴瘤、自身免疫或移植排斥。而我们使用免疫系统及其产物来进行研究和治疗干预。从前沿实验室的最新进展到经过检验的常规方法，我们从不缺少工具。

（作者：Josh P. Roberts / 生物通编译  来源：生物通 www.ebiotrade.com）