仁济医院 干细胞研究中心 方煜翔

当今社会，恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。“早发现、早诊断、早治疗”是目前肿瘤诊断和治疗的重要发展方向和最有效手段。现有肿瘤诊断方法主要包括：影像学检验和常规组织活检，所谓常规组织活检是指从患者体内通过切取、钳取或穿刺等方法取出病灶组织，进行病理学检查的技术。这些常规检验方法存在检测灵敏度低、特异性差、分辨率低、漏检率高、受肿瘤异质性影响大等缺点。通过这些常规检验方法确诊的肿瘤往往已经进展到中晚期，无法为癌症早期诊断及实时疗效评估提供有效帮助。

液体活检技术应用于肿瘤早期诊断的优势

近年来快速发展的肿瘤液体活检技术，为实现肿瘤的早诊断、早发现提供了可能性。液体活检是指通过常规方法抽取静脉血或收集其他体液（如尿液、唾液）后在体液中检测从原发肿瘤细胞脱落进入外周血液循环的各类生物标志物，主要包括循环肿瘤细胞、肿瘤细胞外囊泡、循环肿瘤DNA等。肿瘤液体活检不仅可以用于某些类型的实体肿瘤早期诊断，而且能够监测肿瘤复发、评估疗效，具有标本易获得、创伤性小、非侵入性、可反复采集的优势。

从诊断的灵敏度和获取病理信息能力的角度来比较，与传统的组织活检相比，液体活检的优势之一在于能够反映病灶的综合信息。由于肿瘤细胞存在很强的异质性，传统方法只能获得取样位置的基因信息，不能反映肿瘤整体上的综合信息，而液体活检通过分析肿瘤“分泌物”携带的基因信息可综合反映肿瘤整体的基因信息特点。优势之二在于可以进行高频率监测。肿瘤细胞的基因本身及其表达处于高频变化的状态，必须高频监测才能做到准确用药并预判肿瘤耐药性的产生。液体活检通过简单的体液收集即可实现样本采集的过程，可以满足高频监测的需求。优势之三在于液体活检可以显著降低诊断成本、降低患者的采样风险及引起并发症的风险。

什么是细胞外囊泡？

在众多的肿瘤标志物中，肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡（EV）及囊泡中包含的各类蛋白质（包括囊泡膜表面表达的膜蛋白及内含的蛋白质）、核酸类物质（包括微小RNA，长非编码RNA及编码RNA等）日益成为肿瘤早期诊断的临床研究热点。肿瘤细胞外囊泡是由肿瘤细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡状小体，主要包括外泌体（直径30-150nm）和微囊泡（直径200-1000nm）。细胞外囊泡通过携带母细胞的蛋白、DNA、RNA等生物大分子，直接或间接调控受体细胞的功能和表型，参与细胞病理生理学过程。肿瘤细胞外囊泡在外周血中含量高，结构稳定，可以覆盖肿瘤异质性。

细胞外囊泡携带的生物大分子是潜在的肿瘤标志物

近年来，越来越多的研究表明，细胞外囊泡携带的蛋白质、RNA等生物大分子可以作为潜在的肿瘤标志物应用于肿瘤早期诊断。例如，在胰腺癌的相关研究中，来自美国MD安德森癌症研究中心的RaghuKalluri教授于2015年在国际权威期刊《自然》杂志发表研究论文。他们通过大量的胰腺癌病人血清样本分析发现，在早期胰腺癌病人血清中GPC1阳性的外泌体丰度就显着高于正常人群，而该蛋白在没有疾病或者是有慢性胰腺炎的患者血清来源的外泌体中完全不存在。可见基于检测外泌体膜上GPC1表达量的胰腺癌检测手段，其特异性和敏感性都非常高，更重要的是它可以将慢性胰腺炎与早期或晚期胰腺癌区分开来。另外，不同于循环肿瘤细胞需要大量的新鲜血液，在大约零下八十度已深冷保存30 年的血清样本中依然可以分离和检测出外泌体。由于胰腺在体内的位置相对隐蔽，目前的影像学检测精度在早期很难实现对胰腺癌的诊断。在该教授论文中使用的胰腺癌小鼠模型中，发现当常规的核磁共振防范尚未显示出任何胰腺疾病迹象之时，在小鼠的血清中就已经检测到GPC1阳性外泌体的存在了，后续的观察也确实验证了胰腺部位的肿瘤产生。这一发现强烈提示了在血清中检测是否存在GPC1阳性的外泌体对于胰腺癌这类确诊较难且进展速度极快的恶性肿瘤的早期诊断具有十分重大的临床应用价值。

此外，细胞外囊泡携带的微小RNA同样提示着肿瘤发生发展的潜在的肿瘤标志物。例如，2019年5月，来自日本国立癌症研究中心的落谷孝広教授在国际权威期刊《临床癌症研究》杂志发表研究论文，发现针对血清中细胞外囊泡携带的miR-17-3p及miR- 1185-2-3p这两个microRNA的表达量进行联合评价，相较于现有的检测血液中前列腺特异抗原表达量的方法，可以更有效地区分前列腺癌与良性前列腺增生，实现对前列腺癌的早期诊断并避免对患者进行无效的组织穿刺，减少患者的治疗痛苦并降低患者的医疗成本。

液体活检应用于临床肿瘤早期诊断

如何在成分复杂多样的血清或血浆样本中分离提取尺寸较小的细胞外囊泡，如何提高细胞外囊泡检测方法的灵敏度，是最终实现细胞外囊泡应用于液体活检进行肿瘤早期诊断的关键技术难点和重点。2019年3月，在国际权威期刊《自然—生物医学工程》杂志上发表了来自中科院国家纳米科学中心的孙佳姝教授课题组最新原创性成果。研究人员创新性地利用微流控热泳富集及核酸适体识别技术，无需细胞外囊泡分离提取等操作，在极微量（1微升）的血清或血浆样本中就可对7种细胞外囊泡膜蛋白实现高灵敏、定量、快速、低成本的检测。研究人员首先利用荧光标记的核酸适体特异性识别细胞外囊泡表面肿瘤相关膜蛋白。其次，通过激光照射微流控芯片产生温度梯度诱导的热泳，使直径在30-1000nm的细胞外囊泡快速汇聚至芯片中央，而游离的核酸适体或背景杂蛋白仍保持分散状态。当细胞外囊泡汇聚后，通过采集结合在细胞外囊泡上的荧光核酸适体的信号，获得细胞外囊泡膜蛋白组学信息。最后，通过大数据分析建立相应的生物信息算法，将细胞外囊泡膜蛋白组学信息用于肿瘤的早期自动化分型检测。在孙教授的研究中，已能在3小时内实现对6种常见癌症（包括I-IV期淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌）的早期筛查，并区分不同的癌症类型。

细胞外囊泡识别捕获与分析技术的进步以及高通量数据分析能力的提升，为靶向细胞外囊泡及其内含物的液体活检应用于肿瘤早期诊断提供了有力的技术支撑。大力推广靶向细胞外囊泡及其内含物的各类诊断方案，将有助于推动临床肿瘤早期诊断的普及与常规化。